AAV基因治疗中的拦路石：AAV中和抗体

 

AAV基因治疗的临床试验通常会以中和抗体的存在作为排除标准之一。什么是“中和抗体”？中和抗体阳性的患者真的就无法参与临床试验，只能错过AAV基因治疗的机会吗？结论请见文后小结。

本文讨论要点：(1) AAV中和抗体的流行率；(2) 检测AAV中和抗体所面临的挑战；(3) 中和抗体如何影响AAV基因治疗在临床上的应用？如何突破？

重组腺相关病毒（rAAV）是将自然界存在的野生型AAV经过改造后用于携带治疗基因的重组载体，改造后的rAAV生产更简单，且终产品不携带病毒复制和包装基因Rep和Cap，最大程度保证rAAV的安全性。目前，rAAV是用于体内基因治疗最常见载体，世界范围内共有8款AAV基因治疗产品已获批上市，已开展近300项临床试验。rAAV作为主要的基因递送载体的成功基于多种因素：(1) AAV在自然界中广泛存在，且在人体中暂未发现可引起任何已知疾病；(2) rAAV可以感染非分裂期或慢分裂的细胞，不同血清型具有不同的组织靶向性；(3) rAAV感染后不会复制扩增，且不整合进宿主基因组，以附加体的形式稳定存在，安全性较高的前提下也可长期维持治疗效果；(4) 免疫原性低，rAAV感染后，人体针对被转导细胞的细胞免疫应答的发生率和强度均较低，因此不会发生严重的炎症反应。

图1. 已上市AAV基因治疗产品

野生型AAV是一种非致病性病毒，广泛存在于自然界中，其感染十分常见。30-60% 的人都含有AAV的抗体。抗体阳性比例随年龄上升而升高，也会随地域、血清型等因素变化，且这些抗体在不同血清型中具有广泛的交叉反应性。部分抗体与rAAV结合可阻碍其有效转导目的细胞，被称为中和抗体（NAb）。因此基于治疗的安全性及有效性上的考虑，NAb超过一定滴度的患者通常被排除在研究之外。

图2. 不同血清型AAV的中和抗体在健康人群中的流行率

目前，系统性给药的AAV基因治疗通常会要求患者的NAb水平阴性或低于某一特定滴度。那么如何判定人体中AAV NAb的水平呢？

目前患者AAV NAb水平通常采用体外方法检测。检测流程简单来说，即将患者血清样本进行不同比例的稀释后与AAV报告病毒一起孵育。这里的报告病毒指的是采用与治疗产品相同血清型的AAV，并携带绿色荧光蛋白或荧光素酶等易于检测的报告基因。将孵育后的AAV报告病毒—血清混合物添加到细胞中进行感染，若患者血清样本中含有中和抗体，那么孵育后的病毒将失去部分感染能力，最后将体现为感染后报告基因表达量减少。将感染后的细胞培养一定时间后，即可检测报告基因表达的蛋白水平。采用无血清处理的病毒作为对照组。待检测样品的中和抗体的滴度定义为，待检样品组中报告蛋白表达量相比对照组减少50%时患者血清的最高稀释度。

由于该检测方法基于细胞实验，通常面临着实验检测误差较大的问题。这些误差通常来源于被感染细胞的状态、细胞培养时添加的血清的质量、所使用的AAV报告病毒的质量、实验人员的操作等。另外各家实验室实际使用的实验条件也存在较大差异。例如，在血友病A试验（NCT02576795）中，BioMarin公司只招募AAV5 NAb阴性的患者，他们的 NAb 检测时使用的报告病毒基因组/细胞的感染复数为25,000。与之相对的，另一项血友病B试验（NCT03489291）在检测AAV NAb时所采用的的感染复数仅为378.4。显然，采用感染复数为25,000或378.4将产生截然不同中和抗体滴度检测结果。

除体外检测的方法外，也有研究人员采用动物体内检测的方法来确定人或非人灵长类动物（NHP）血清的中和抗体滴度。这些检测需要用人或NHP血清对小鼠进行被动免疫，看似更敏感，但因繁琐和昂贵，对于筛选大量潜在患者群体这个目标并不实用。

因此，基于AAV基因治疗迅速发展的现状，监管机构对于NAb体外检测标准化势在必行。

AAV中和抗体的存在同时影响了AAV基因治疗的安全性与有效性，主要体现在如下几个方面：

  1.  1.      AAV NAb影响基因治疗的安全性

血液循环中的AAV抗体会与系统性给药的rAAV颗粒结合形成抗原抗体复合物，抗原抗体复合物会引发一系列免疫反应。Barry J. Byrne团队研究了AAV抗原抗体复合物引发免疫反应的机制，并得出结论，AAV系统性给药后大量的抗原抗体复合物会通过经典抗体途径激活免疫，并通过补体激活途径放大，最终可能引发危及生命的炎症反应，包括血栓性微血管病（TMA）。TMA是AAV系统性给药后最为严重的副反应之一，一些高剂量的AAV基因治疗试验也曾因为引发了TMA而被监管机构叫停。因此筛选并控制AAV NAb水平也是保证AAV基因治疗的关键因素。

  1.  2.      预存的AAV NAb影响基因治疗有效性

血液循环中的AAV NAb与系统性给药的rAAV结合后，直接影响了rAAV对于靶器官细胞的转导能力，因此将直接影响rAAV给药后的有效性。对于某些血清型的rAAV，即使非常低水平的NAb也会极大影响其感染能力。Leszek Lisowski团队曾报道过，在小鼠与非人灵长类动物实验中，即使滴度低至约1:20的AAV8 NAb依然严重影响了AAV8在动物中的感染。不少临床实验中也观察到了AAV NAb对于给药后药物有效性的影响。例如Prevail公司发表的针对额颞型痴呆的基因治疗产品PR006临床1/2期结果的文献中提到，相较于AAV9 NAb阴性的患者，阳性患者给药后外周血目的蛋白的表达水平较低，且衰减幅度更大，在极短时间内，目的蛋白表达均降回基线水平。然而也有一些临床试验曾得出过截然相反的结论，例如一项针对血友病A的临床试验使用了AAV5作为载体。研究人员在分析了其I/II/III期临床结果后（NCT03569891），得出的结论是患者体内的预存抗体并不会影响该治疗的有效性，这可能与AAV5相较于其他AAV血清型衣壳结构较特殊的原因有关。总之在大多数的临床前及临床数据中均证明，患者体内预存的AAV NAb将会极大影响AAV基因治疗给药后的有效性，但这种特性也取决于使用的AAV血清型。

那么如何突破AAV NAb给基因治疗带来的限制呢？目前主要的方法有如下三种：

  1.  1.   改造AAV外壳。在AAV衣壳受体结合区中引入突变，以创造与野生型AAV衣壳差异较大的新血清型，以规避NAb。然后不同血清型之间通常存在显著的交叉反应，引入变异规避中和反应并不容易，同时，引入的突变也有可能严重影响rAAV的感染性及靶向性，影响疗效。

  2.  2.  血浆置换。将静脉内IgG抗体或人血清与AAV共价偶联磁珠共同孵育，可去除中和抗体/因子。该思路已在大鼠中得到验证，但还需要在大动物模型中证明可行性。同时血浆置换效率不等，可能需要多轮置换才能将预存抗体清除至较低水平，对于设备和场地也有着较高的要求。

  3.  3.  去除IgG。利用链球菌半胱氨酸蛋白酶(IdeS) 或其同源物IdeZ将IgG切割成F(ab')2和Fc片段，解除其中和功效。该思路已在被动免疫的小鼠中得到验证。IdeS处理不仅可以在中和抗体阳性的NHP中成功实现转导，甚至可以实现使用相同的AAV血清型的重新给药。目前已有一些基于此类思路开展的临床实验，如NCT06241950旨在评估在AAVrh74预存抗体阳性的患者中使用IdeS处理后再进行SRP-9001基因药物治疗的安全性与有效性。

  4.  

AAV中和抗体（NAb）是人体在感染了AAV后产生的一种可以与AAV结合，阻碍它进入细胞的一种特殊的抗体。因为AAV广泛存在于自然界中，感染的情况十分常见，30-60% 的人都含有AAV的抗体。为了提高AAV治疗的安全性和有效性，NAb超过一定滴度的患者通常被排除在研究之外。科学家们正在探索从以下角度来解决这个阻碍：(1) 改造AAV衣壳；(2) 血浆置换清除抗体；(3) 利用IdeS/IdeZ酶降解抗体。目前已有临床试验对第三种方案进行评估，相信不久的将来，一定会有更多的患者能获益于AAV基因治疗！

参考文献：

  1.  1. Weber, Thomas. “Anti-AAV Antibodies in AAV Gene Therapy: Current Challenges and Possible Solutions.” Frontiers in immunology vol. 12 658399. 17 Mar. 2021, doi:10.3389/fimmu.2021.658399

  2.  2. Westhaus, Adrian et al. “Assessment of Pre-Clinical Liver Models Based on Their Ability to Predict the Liver-Tropism of Adeno-Associated Virus Vectors.” Human gene therapy vol. 34,7-8 (2023): 273-288. doi:10.1089/hum.2022.188

  3.  3. Sevigny, Jeffrey et al. “Progranulin AAV gene therapy for frontotemporal dementia: translational studies and phase 1/2 trial interim results.” Nature medicine vol. 30,5 (2024): 1406-1415. doi:10.1038/s41591-024-02973-0

  4.  4. Salabarria, Stephanie M et al. “Thrombotic microangiopathy following systemic AAV administration is dependent on anti-capsid antibodies.” The Journal of clinical investigation vol. 134,1 e173510. 2 Jan. 2024, doi:10.1172/JCI173510

  5.  5. Boutin S et al. ‘’Prevalence of serum IgG and neutralizing factors against adeno-associated virus (AAV) types 1, 2, 5, 6, 8, and 9 in the healthy population: implications for gene therapy using AAV vectors.’’ Hum Gene Ther. 2010 Jun;21(6):704-12. doi: 10.1089/hum.2009.182.